The 20 reference contexts in paper G. Skitovich S., N. Shadrova B., O. Pruntova V., K. Serova V., Г. Скитович С., Н. Шадрова Б., О. Прунтова В., К. Серова В. (2018) “ОПТИМИЗАЦИЯ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОМА LISTERIA MONOCYTOGENES // REAL-TIME PCR OPTIMIZATION FOR LISTERIA MONOCYTOGENES GENOME DETECTION” / spz:neicon:veterinary:y:2018:i:3:p:63-68

  1. Start
    6339
    Prefix
    ДНК выделяли из образцов чистых культур с помощью на­ бора «СОРБ­ГМО­А» («Синтол», Москва) в соответствии с рекомендациями производителя. Олигонуклеотиды. Праймеры и зонды для идентифи­ кации бактерий L. monocytogenes, используемые в дан­ ной работе и описанные ранее в работе D. Rodrígues­ Lázaro и соавт.
    Exact
    [25]
    Suffix
    (GenBank AY174670 – AY174682), были синтезированы фирмой «Синтол». Первичная структура олигонуклеотидов представлена в таблице 1. Условия проведения ПЦР-РВ. Для постановки ПЦР использовали «Набор реагентов для проведения ПЦР­РВ» («Синтол», Россия).
    (check this in PDF content)

  2. Start
    7552
    Prefix
    Листериоз не является широко распространенной инфекцией. По количеству выявленных случаев он значитель­ но уступает сальмонеллезам и кампилобактериозам, но превосходит их по тяжести клинического течения и проценту летальных исходов
    Exact
    [1]
    Suffix
    . L. monocytogenes обычно сосуществуют с другими видами этого рода, такими как непатогенная Listeria innocua, которая мо­ жет быть использована в качестве индикатора возмож­ ного присутствия L. monocytogenes в пищевых продук­ тах [15].
    (check this in PDF content)

  3. Start
    7796
    Prefix
    L. monocytogenes обычно сосуществуют с другими видами этого рода, такими как непатогенная Listeria innocua, которая мо­ жет быть использована в качестве индикатора возмож­ ного присутствия L. monocytogenes в пищевых продук­ тах
    Exact
    [15]
    Suffix
    . Требования безопасности пищевых продуктов, принятые в большинстве стран, не допускают наличия L. monocytogenes [6, 18]. Идентификация L. monocytogenes в соответствии с действующими нормативными документами осу­ ществляется традиционными микробиологическими (микроскопия, посев на питательные среды) и сероло­ гическими методами (реакция агглютинации, реакция связывания комплемента)
    (check this in PDF content)

  4. Start
    7913
    Prefix
    L. monocytogenes обычно сосуществуют с другими видами этого рода, такими как непатогенная Listeria innocua, которая мо­ жет быть использована в качестве индикатора возмож­ ного присутствия L. monocytogenes в пищевых продук­ тах [15]. Требования безопасности пищевых продуктов, принятые в большинстве стран, не допускают наличия L. monocytogenes
    Exact
    [6, 18]
    Suffix
    . Идентификация L. monocytogenes в соответствии с действующими нормативными документами осу­ ществляется традиционными микробиологическими (микроскопия, посев на питательные среды) и сероло­ гическими методами (реакция агглютинации, реакция связывания комплемента) [4, 8].
    (check this in PDF content)

  5. Start
    8192
    Prefix
    Идентификация L. monocytogenes в соответствии с действующими нормативными документами осу­ ществляется традиционными микробиологическими (микроскопия, посев на питательные среды) и сероло­ гическими методами (реакция агглютинации, реакция связывания комплемента)
    Exact
    [4, 8]
    Suffix
    . Однако время исследований традиционными ме­ тодами варьирует от 3–4 дней при отрицательном результате, а для подтверждения положительного результата требуется до 7 дней [24]. Обнаружение L. monocytogenes в продуктах животного происхожде­ ния микробиологическим методом затруднено из­за высокой концентрации конкурентоспособной микро­ флоры, низкого уровня L. monocyto
    (check this in PDF content)

  6. Start
    8388
    Prefix
    документами осу­ ществляется традиционными микробиологическими (микроскопия, посев на питательные среды) и сероло­ гическими методами (реакция агглютинации, реакция связывания комплемента) [4, 8]. Однако время исследований традиционными ме­ тодами варьирует от 3–4 дней при отрицательном результате, а для подтверждения положительного результата требуется до 7 дней
    Exact
    [24]
    Suffix
    . Обнаружение L. monocytogenes в продуктах животного происхожде­ ния микробиологическим методом затруднено из­за высокой концентрации конкурентоспособной микро­ флоры, низкого уровня L. monocytogenes и наличия ингибирующих листерию пищевых компонентов [23].
    (check this in PDF content)

  7. Start
    8651
    Prefix
    Обнаружение L. monocytogenes в продуктах животного происхожде­ ния микробиологическим методом затруднено из­за высокой концентрации конкурентоспособной микро­ флоры, низкого уровня L. monocytogenes и наличия ингибирующих листерию пищевых компонентов
    Exact
    [23]
    Suffix
    . Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР­РВ) представляет собой быструю и прак­ тичную альтернативу микробиологическому методу. Поэтому разработка видоспецифичных методов ПЦР для выявления генома L. monocytogenes является ак­ туальной задачей.
    (check this in PDF content)

  8. Start
    9046
    Prefix
    Поэтому разработка видоспецифичных методов ПЦР для выявления генома L. monocytogenes является ак­ туальной задачей. Молекулярные методы, такие как ПЦР, позволяют быстро обнаружить и идентифицировать бактериаль­ ные патогены
    Exact
    [27]
    Suffix
    . В литературе приведены результаты по применению нескольких традиционных ПЦР, по­ зволяющих выявлять L. monocytogenes [13, 15, 19, 21]. А также описаны варианты ПЦР­РВ для ее обнаруже­ ния [2, 12, 16, 26, 28].
    (check this in PDF content)

  9. Start
    9173
    Prefix
    Молекулярные методы, такие как ПЦР, позволяют быстро обнаружить и идентифицировать бактериаль­ ные патогены [27]. В литературе приведены результаты по применению нескольких традиционных ПЦР, по­ зволяющих выявлять L. monocytogenes
    Exact
    [13, 15, 19, 21]
    Suffix
    . А также описаны варианты ПЦР­РВ для ее обнаруже­ ния [2, 12, 16, 26, 28]. При идентификации L. monocytogenes в настоящее время в качестве мишеней для ПЦР используют различ­ ные гены: 16S и 23S рРНК, prs, gyrB, rpoB, hly, inlA и inlB, plcA, iap и др. [3, 7, 10, 11, 14, 15, 17, 20, 22, 30].
    (check this in PDF content)

  10. Start
    9250
    Prefix
    В литературе приведены результаты по применению нескольких традиционных ПЦР, по­ зволяющих выявлять L. monocytogenes [13, 15, 19, 21]. А также описаны варианты ПЦР­РВ для ее обнаруже­ ния
    Exact
    [2, 12, 16, 26, 28]
    Suffix
    . При идентификации L. monocytogenes в настоящее время в качестве мишеней для ПЦР используют различ­ ные гены: 16S и 23S рРНК, prs, gyrB, rpoB, hly, inlA и inlB, plcA, iap и др. [3, 7, 10, 11, 14, 15, 17, 20, 22, 30].
    (check this in PDF content)

  11. Start
    9444
    Prefix
    А также описаны варианты ПЦР­РВ для ее обнаруже­ ния [2, 12, 16, 26, 28]. При идентификации L. monocytogenes в настоящее время в качестве мишеней для ПЦР используют различ­ ные гены: 16S и 23S рРНК, prs, gyrB, rpoB, hly, inlA и inlB, plcA, iap и др.
    Exact
    [3, 7, 10, 11, 14, 15, 17, 20, 22, 30]
    Suffix
    . Целью данного исследования была оптимиза­ ция качественной ПЦР­РВ для обнаружения генома L. monocytogenes при исследовании пищевых продук­ тов животного происхождения. Таблица 1 Структура праймеров и зонда [по D.
    (check this in PDF content)

  12. Start
    10949
    Prefix
    По результатам анализа литера­ турных данных для проведения ПЦР­РВ был выбран ген iap (GenBank, No Х52268), который кодирует по­ верхностный белок р60, известный также как гидро­ лаза клеточной стенки
    Exact
    [29]
    Suffix
    . Основанием для выбора явилось то, что этот белок у L. monocytogenes имеет две уникальные области последовательностей, отсутству­ ющие у других видов листерий, что делает его высоко­ специфичным и подходящим для точной качественной оценки всех штаммов L. monocytogenes [1].
    (check this in PDF content)

  13. Start
    11225
    Prefix
    Основанием для выбора явилось то, что этот белок у L. monocytogenes имеет две уникальные области последовательностей, отсутству­ ющие у других видов листерий, что делает его высоко­ специфичным и подходящим для точной качественной оценки всех штаммов L. monocytogenes
    Exact
    [1]
    Suffix
    . Сравнивая iap­родственные гены разных видов листерий, A. Burbert и соавт. [15] определили общие и переменные области в пределах этих генов, специ­ фичных для каждого из видов Listeria.
    (check this in PDF content)

  14. Start
    11312
    Prefix
    Основанием для выбора явилось то, что этот белок у L. monocytogenes имеет две уникальные области последовательностей, отсутству­ ющие у других видов листерий, что делает его высоко­ специфичным и подходящим для точной качественной оценки всех штаммов L. monocytogenes [1]. Сравнивая iap­родственные гены разных видов листерий, A. Burbert и соавт.
    Exact
    [15]
    Suffix
    определили общие и переменные области в пределах этих генов, специ­ фичных для каждого из видов Listeria. Основываясь на этих последовательностях гена iap, были разрабо­ таны праймеры ПЦР для L. monocytogenes (табл. 1) [25].
    (check this in PDF content)

  15. Start
    11544
    Prefix
    Burbert и соавт. [15] определили общие и переменные области в пределах этих генов, специ­ фичных для каждого из видов Listeria. Основываясь на этих последовательностях гена iap, были разрабо­ таны праймеры ПЦР для L. monocytogenes (табл. 1)
    Exact
    [25]
    Suffix
    . Оптимизация ПЦР-РВ для специфического обнаружения бактерий L. monocytogenes. Оптимизация ПЦР­РВ включает следующие этапы: определение точной тем­ пературы отжига праймеров и концентрацию ионов магния, при которых отмечается наивысшая интенсив­ ность ответного флуоресцентного сигнала, при высо­ кой специфичности.
    (check this in PDF content)

  16. Start
    11967
    Prefix
    Оптимизация ПЦР­РВ включает следующие этапы: определение точной тем­ пературы отжига праймеров и концентрацию ионов магния, при которых отмечается наивысшая интенсив­ ность ответного флуоресцентного сигнала, при высо­ кой специфичности. Оптимальная температура отжига определяется структурой праймеров и обычно варьи­ рует от 55 до 72 °C
    Exact
    [9]
    Suffix
    . Для расчета температуры отжига праймеров ис­ пользовали формулу Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C), где Tm – температура отжига, °C; А, Т, C, G – нуклеотидные основания [9]. В результате проведенных расчетов были получены температуры отжига 66 °С для прямого и 76 °С для об­ ратного праймеров.
    (check this in PDF content)

  17. Start
    12137
    Prefix
    Оптимальная температура отжига определяется структурой праймеров и обычно варьи­ рует от 55 до 72 °C [9]. Для расчета температуры отжига праймеров ис­ пользовали формулу Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C), где Tm – температура отжига, °C; А, Т, C, G – нуклеотидные основания
    Exact
    [9]
    Suffix
    . В результате проведенных расчетов были получены температуры отжига 66 °С для прямого и 76 °С для об­ ратного праймеров. Для пары праймеров, имеющих разную температуру отжига, при написании програм­ мы ПЦР выбирается наименьшая.
    (check this in PDF content)

  18. Start
    13074
    Prefix
    На основании проведенного эксперимента опти­ мальной была выбрана температура отжига 57 °С. Оптимизировали концентрации праймеров и зон­ да для специфичного анализа с использованием тех же циклов, что и для разработанного ранее анализа ПЦР­РВ
    Exact
    [5]
    Suffix
    . Оптимальные условия, которые показывают наименьшее значение для порогового цикла (Ct) с наи­ меньшими концентрациями праймеров и зонда (рис. 1), указаны в материалах и методах. Определение чувствительности оптимизированной ПЦР-РВ.
    (check this in PDF content)

  19. Start
    13663
    Prefix
    Для оценки чувствительности реакции использовали выделенную ДНК, концентрация которой составила 4 нг/мкл. В соответствии со средним размером генома раз­ личных исследуемых микроорганизмов 1 нг геном­ ной ДНК соответствует как минимум 3 × 105 клеткам
    Exact
    [28]
    Suffix
    . Таким образом, концентрация ДНК 4 нг/мкл со­ ответствует приблизительно 12 × 105 бактериальным клеткам. Чувствительность ПЦР­РВ определяли путем по­ становки реакций 10­кратных разведений выделен­ ной ДНК, начиная с максимальной, равной 4 нг/мкл, и до 4 × 10­6 нг/мкл, что соответствует 1,2 бактериаль­ ной клетки в реакции.
    (check this in PDF content)

  20. Start
    15403
    Prefix
    Результаты показали, что скрининговые исследова­ ния на основе оптимизированной ПЦР­РВ обеспечива­ ют быстрые и надежные результаты. клеток в образце, что согласуется с данными других исследователей
    Exact
    [12, 25]
    Suffix
    . Содержание в образце ДНК L. monocytogenes, соответствующее приблизительно 12 бактериальным клеткам, выявили только в одной ПЦР­РВ из трех проведенных (табл. 2). Определение специфичности.
    (check this in PDF content)