The 33 reference contexts in paper A. Ryabokon M., E. Anaev Kh., A. Kononikhin S., N. Starodubtseva L., G. Kireeva Kh., I. Popov A., E. Kukaev N., V. Barmin V., V. Bagrov A., O. Pikin V., E. Nikolaev N., S. Varfolomeev D., А. Рябоконь М., Э. Анаев Х., А. Кононихин С., Н. Стародубцева Л., Г. Киреева Х., И. Попов А., Е. Кукаев Н., В. Бармин В., В. Багров А., О. Пикин В., Е. Николаев Н., С. Варфоломеев Д. (2014) “СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ КОНДЕНСАТА ВЫДЫХАЕМОГО ВОЗДУХА У ПАЦИЕНТОВ С РАКОМ ЛЕГКОГО МЕТОДОМ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ // COMPARATIVE PROTEOMIC ANALYSIS OF EXHALED BREATH CONDENSATE IN PATIENTS WITH LUNG CARCINOMA USING HIGH RESOLUTION MASS-SPECTROMETRY” / spz:neicon:pulmonology:y:2014:i:1:p:5-11

  1. Start
    4975
    Prefix
    Однако необходимы дальнейшие исследования для определения диагностической значимости предложенных биомаркеров и их роли в патогенезе РЛ. Ключевые слова:рак легкого, диагностика, конденсат выдыхаемого воздуха, протеомный анализ, хромато-масс-спектрометрия. интерес
    Exact
    [1–3]
    Suffix
    . Конденсат выдыхаемого воздуха (КВВ) собирается с помощью специальных стандартных устройств и может быть проанализирован с помощью различных химических, иммунохимических, метаболомных и протеомных методов.
    (check this in PDF content)

  2. Start
    5624
    Prefix
    Бронхиальный секрет дистальных отделов дыхательных путей содержит ряд нелетучих и > 200 летучих соединений, большинство из которых относится к биомаркерам болезней органов дыхания
    Exact
    [4, 5]
    Suffix
    . В основном поиск биомаркеров воспаления ведется среди липидов – метаболитов арахидоновой кислоты (простагландины, лейкотриены, изопростаны и др.) [6] и белков – цитокинов (интерлейкины, фактор некроза опухолиαи др.) [7].
    (check this in PDF content)

  3. Start
    5794
    Prefix
    Бронхиальный секрет дистальных отделов дыхательных путей содержит ряд нелетучих и > 200 летучих соединений, большинство из которых относится к биомаркерам болезней органов дыхания [4, 5]. В основном поиск биомаркеров воспаления ведется среди липидов – метаболитов арахидоновой кислоты (простагландины, лейкотриены, изопростаны и др.)
    Exact
    [6]
    Suffix
    и белков – цитокинов (интерлейкины, фактор некроза опухолиαи др.) [7]. К пневмоопухолевым маркерам относятся также различные маркеры ангиогенеза (ангиогенин), концентрация которых значительно повышается у больных с III–IV стадией рака [8].
    (check this in PDF content)

  4. Start
    5867
    Prefix
    В основном поиск биомаркеров воспаления ведется среди липидов – метаболитов арахидоновой кислоты (простагландины, лейкотриены, изопростаны и др.) [6] и белков – цитокинов (интерлейкины, фактор некроза опухолиαи др.)
    Exact
    [7]
    Suffix
    . К пневмоопухолевым маркерам относятся также различные маркеры ангиогенеза (ангиогенин), концентрация которых значительно повышается у больных с III–IV стадией рака [8]. Кератины являются основными цитоскелетными белками в КВВ и некоторые из них уже используются для медицинской диагностики рака легкого (РЛ) [9, 10].
    (check this in PDF content)

  5. Start
    6036
    Prefix
    поиск биомаркеров воспаления ведется среди липидов – метаболитов арахидоновой кислоты (простагландины, лейкотриены, изопростаны и др.) [6] и белков – цитокинов (интерлейкины, фактор некроза опухолиαи др.) [7]. К пневмоопухолевым маркерам относятся также различные маркеры ангиогенеза (ангиогенин), концентрация которых значительно повышается у больных с III–IV стадией рака
    Exact
    [8]
    Suffix
    . Кератины являются основными цитоскелетными белками в КВВ и некоторые из них уже используются для медицинской диагностики рака легкого (РЛ) [9, 10]. Так, тест-система CYFRA 21-1 применяется в клинической практике для измерения уровня фрагмента кератина-19, который экспрессируется опухолевыми клетками в кровь.
    (check this in PDF content)

  6. Start
    6183
    Prefix
    К пневмоопухолевым маркерам относятся также различные маркеры ангиогенеза (ангиогенин), концентрация которых значительно повышается у больных с III–IV стадией рака [8]. Кератины являются основными цитоскелетными белками в КВВ и некоторые из них уже используются для медицинской диагностики рака легкого (РЛ)
    Exact
    [9, 10]
    Suffix
    . Так, тест-система CYFRA 21-1 применяется в клинической практике для измерения уровня фрагмента кератина-19, который экспрессируется опухолевыми клетками в кровь. Данный подход используется для мониторинга и оценки ответа на терапевтические вмешательства, в частности в случае плоскоклеточного РЛ [9].
    (check this in PDF content)

  7. Start
    6522
    Prefix
    Так, тест-система CYFRA 21-1 применяется в клинической практике для измерения уровня фрагмента кератина-19, который экспрессируется опухолевыми клетками в кровь. Данный подход используется для мониторинга и оценки ответа на терапевтические вмешательства, в частности в случае плоскоклеточного РЛ
    Exact
    [9]
    Suffix
    . Показано, что кератин-19 присутствует в плевральной жидкости больных РЛ [10]. Одновременное определение 2 различных опухолевых маркеров – CYFRA 21-1 и карциноэмбрионального антигена, локализованного в мембранах эпителиальных клеток, увеличивает точность диагностики [11].
    (check this in PDF content)

  8. Start
    6601
    Prefix
    Данный подход используется для мониторинга и оценки ответа на терапевтические вмешательства, в частности в случае плоскоклеточного РЛ [9]. Показано, что кератин-19 присутствует в плевральной жидкости больных РЛ
    Exact
    [10]
    Suffix
    . Одновременное определение 2 различных опухолевых маркеров – CYFRA 21-1 и карциноэмбрионального антигена, локализованного в мембранах эпителиальных клеток, увеличивает точность диагностики [11].
    (check this in PDF content)

  9. Start
    6815
    Prefix
    Одновременное определение 2 различных опухолевых маркеров – CYFRA 21-1 и карциноэмбрионального антигена, локализованного в мембранах эпителиальных клеток, увеличивает точность диагностики
    Exact
    [11]
    Suffix
    . Кроме того, было показано, что кальций-связывающий белок S100A7 может быть использован в качестве потенциального маркера некоторых форм РЛ, таких как крупноклеточная карцинома [12]. Очевидно, что число различных биомаркеров болезней органов дыхания, идентифицированных в КВВ, будет увеличиваться в ходе дальнейших исследований.
    (check this in PDF content)

  10. Start
    7004
    Prefix
    Одновременное определение 2 различных опухолевых маркеров – CYFRA 21-1 и карциноэмбрионального антигена, локализованного в мембранах эпителиальных клеток, увеличивает точность диагностики [11]. Кроме того, было показано, что кальций-связывающий белок S100A7 может быть использован в качестве потенциального маркера некоторых форм РЛ, таких как крупноклеточная карцинома
    Exact
    [12]
    Suffix
    . Очевидно, что число различных биомаркеров болезней органов дыхания, идентифицированных в КВВ, будет увеличиваться в ходе дальнейших исследований. Мощный инструмент протеомики – высокоэффективная жидкостная хроматография и тандемная масс-спектрометрия (ВЭЖХ-МС / МС) остается в настоящее время самым эффективным методом для наиболее полного описания белкового соста
    (check this in PDF content)

  11. Start
    8260
    Prefix
    данное методологическое преимущество представляется критичным, поскольку нанограммовые концентрации потенциальных белков-маркеров в образце КВВ определяютсяin situна фоне основных цитоскелетных белков и сложной низкомолекулярной матрицы неизвестного состава. В предыдущих исследованиях анализировались показатели КВВ у молодых здоровых некурящих доноров методом ВЭЖХ-МС / МС
    Exact
    [13, 14]
    Suffix
    . Проведено сравнение различных способов концентрирования белка с целью оптимизации подготовки КВВ к протеомному анализу [13]. В результате была разработана новая потенциальная платформа для биомедицинской диагностики, основанная на протеомном анализе неинвазивно получаемого КВВ человека [13, 14].
    (check this in PDF content)

  12. Start
    8391
    Prefix
    В предыдущих исследованиях анализировались показатели КВВ у молодых здоровых некурящих доноров методом ВЭЖХ-МС / МС [13, 14]. Проведено сравнение различных способов концентрирования белка с целью оптимизации подготовки КВВ к протеомному анализу
    Exact
    [13]
    Suffix
    . В результате была разработана новая потенциальная платформа для биомедицинской диагностики, основанная на протеомном анализе неинвазивно получаемого КВВ человека [13, 14]. Платформа была использована для мониторинга изменения протеомного состава КВВ пациента после 1-й в России успешной билатеральной трансплантации легких в 2006 г. [15].
    (check this in PDF content)

  13. Start
    8574
    Prefix
    Проведено сравнение различных способов концентрирования белка с целью оптимизации подготовки КВВ к протеомному анализу [13]. В результате была разработана новая потенциальная платформа для биомедицинской диагностики, основанная на протеомном анализе неинвазивно получаемого КВВ человека
    Exact
    [13, 14]
    Suffix
    . Платформа была использована для мониторинга изменения протеомного состава КВВ пациента после 1-й в России успешной билатеральной трансплантации легких в 2006 г. [15]. Также впервые было показано, что экзогенные и эндогенные белки могут быть дифференцированы в выдыхаемом воздухе человека [16].
    (check this in PDF content)

  14. Start
    8750
    Prefix
    В результате была разработана новая потенциальная платформа для биомедицинской диагностики, основанная на протеомном анализе неинвазивно получаемого КВВ человека [13, 14]. Платформа была использована для мониторинга изменения протеомного состава КВВ пациента после 1-й в России успешной билатеральной трансплантации легких в 2006 г.
    Exact
    [15]
    Suffix
    . Также впервые было показано, что экзогенные и эндогенные белки могут быть дифференцированы в выдыхаемом воздухе человека [16]. В данном исследовании использована ранее разработанная методологическая платформа для анализа КВВ с целью выявления белков-онкомаркеров в образцах, полученных у больных РЛ.
    (check this in PDF content)

  15. Start
    8893
    Prefix
    Платформа была использована для мониторинга изменения протеомного состава КВВ пациента после 1-й в России успешной билатеральной трансплантации легких в 2006 г. [15]. Также впервые было показано, что экзогенные и эндогенные белки могут быть дифференцированы в выдыхаемом воздухе человека
    Exact
    [16]
    Suffix
    . В данном исследовании использована ранее разработанная методологическая платформа для анализа КВВ с целью выявления белков-онкомаркеров в образцах, полученных у больных РЛ. Целью исследования была идентификация потенциальных белков-онкомаркеров в КВВ у больных РЛ методом ВЭЖХ-МС / МС.
    (check this in PDF content)

  16. Start
    10366
    Prefix
    КВВ собирались в течение 10 мин с использованием предварительно охлажденной до –20 °С R-Tube (Respiratory Research, США). Собранные пробы помещались в полипропиленовые пробирки, замораживались и хранились в морозильнике при –85 °C до проведения анализа в соответствии с ранее опубликованным протоколом
    Exact
    [13]
    Suffix
    . Подготовка образцов для масс-спектрометрического анализа Аликвота КВВ (объем ≈1 мл) переносилась в полипропиленовые пробирки с низкой белок-абсорбирующей поверхностью, устойчивые к низким температурам, и лиофилизировались в тех же пробирках до полного высыхания.
    (check this in PDF content)

  17. Start
    11009
    Prefix
    Затем образцы КВВ подвергались гидролизу модифицированным трипсином (Promega, США), добавленным в соотношении фермент / белок – 1 : 100 (по массе) в 0,05М NH4HCO3 буфер (рН 8,0) при 30 °C. Реакция останавливалась после 20 ч инкубации добавлением 2 мкл 1%-ного раствора муравьиной кислоты
    Exact
    [13]
    Suffix
    . Полученный раствор анализировался с помощью нанопоточной ВЭЖХ-МС / МС. ВЭЖХ-МС / МС Эксперименты ВЭЖХ-МС / МС проводились на системе, состоящей из хроматографа Agilent 1100 (Agilent Technologies Inc.
    (check this in PDF content)

  18. Start
    11825
    Prefix
    Объем вводимой на колонку пробы составлял 1 мкл, использовалась колонка 75 мкм ×12 см с фазой Reprosil-Pur Basic C18, 3 мкм (Dr. Maisch HPLC GmbH, Аммербух-Энтринген, Германия), изготовленная в лаборатории по методике Манна и др.
    Exact
    [17]
    Suffix
    . В качестве подвижной фазы использовались: растворитель А: 0,1%-ный раствор муравьиной кислоты в H2O-HCOOH (1 000 : 1 по объему); растворитель В: 0,1%-ный раствор муравьиной кислоты в CH3CN-HCOOH (1 000 : 1 по объему).
    (check this in PDF content)

  19. Start
    13898
    Prefix
    Также считалось, что пептид идентифицирован верно, если вероятность его определения была > 95,0 % согласно алгоритму Peptide Prophet. Считается, что для надежной идентификации белков вероятность их определения должна быть > 99,0 % согласно алгоритму Peptide Prophet
    Exact
    [18]
    Suffix
    . Результаты и обсуждение Белковый профиль образцов КВВ определялся у 2 групп доноров. Клинические характеристики обследованных групп представлены в табл. 1. Средний возраст больных составил 56,5 года (45–68 лет), 80,8 % из них были мужского пола, 54 % – курильщики.
    (check this in PDF content)

  20. Start
    15575
    Prefix
    4)– 110 (38)– 214 (54)– 31 (4)– 40– M-дескриптор, n(%): 021 (81)– 15 (19)– 20– 30– 40– Рябоконь А.М. и др.Сравнительный протеомный анализ конденсата выдыхаемого воздуха у пациентов с раком легкого 99,9 %, рейтинг пептида > 24, ложные идентификации – 0,87 %. Считалось, что пептид идентифицирован верно, если вероятность его определения была > 95,0 % согласно алгоритмуPeptide Prophet
    Exact
    [18]
    Suffix
    . Как и ожидалось, основные группы идентифицированных белков (65 %) представляли кератины, в т. ч. цитоскелетные кератины 1-го типа (1, 2, 5, 6А), цитоскелетные 2-го типа (9, 10, 14, 16, 17), и группа транспортных белков: альбумин, липокалин-1.
    (check this in PDF content)

  21. Start
    15959
    Prefix
    Как и ожидалось, основные группы идентифицированных белков (65 %) представляли кератины, в т. ч. цитоскелетные кератины 1-го типа (1, 2, 5, 6А), цитоскелетные 2-го типа (9, 10, 14, 16, 17), и группа транспортных белков: альбумин, липокалин-1. Эти т. н. основные белки составляют 80–90 % общего количества белка КВВ, что согласуется с результатами предыдущих исследований
    Exact
    [13]
    Suffix
    . Наиболее часто встречающимися белками во всех образцах были цитокератины 1-го и 2-го типов (1, 2, 5, 6, 9, 10, 14). Согласно каталогу белков человека, цитокератины 1, 2, 9, 10 имеют эпидермальное происхождение, поэтому считается, что данные белки либо вносятся при пробоподготовке, либо имеют экзогенные происхождение, т. е. не относятся к белкам дыхательных путей [19
    (check this in PDF content)

  22. Start
    16358
    Prefix
    Согласно каталогу белков человека, цитокератины 1, 2, 9, 10 имеют эпидермальное происхождение, поэтому считается, что данные белки либо вносятся при пробоподготовке, либо имеют экзогенные происхождение, т. е. не относятся к белкам дыхательных путей
    Exact
    [19]
    Suffix
    . В предыдущем исследовании [13, 16] выдвинуто предположение, что эти экзогенные кератины в КВВ являются свободно циркулирующими белками воздуха и должны быть исключены из дальнейшего анализа протеома КВВ.
    (check this in PDF content)

  23. Start
    16390
    Prefix
    Согласно каталогу белков человека, цитокератины 1, 2, 9, 10 имеют эпидермальное происхождение, поэтому считается, что данные белки либо вносятся при пробоподготовке, либо имеют экзогенные происхождение, т. е. не относятся к белкам дыхательных путей [19]. В предыдущем исследовании
    Exact
    [13, 16]
    Suffix
    выдвинуто предположение, что эти экзогенные кератины в КВВ являются свободно циркулирующими белками воздуха и должны быть исключены из дальнейшего анализа протеома КВВ. Обнаружено достоверное различие (р< 0,05) содержания кератинов 5, 6, 14, имеющих эндогенное происхождение, в КВВ контрольной группы и группы с онкопатологией (рис. 1).
    (check this in PDF content)

  24. Start
    17056
    Prefix
    Уровень этих кератинов значительно выше в группе больных РЛ по сравнению со здоровым контролем. Методом ELISA ранее были получены данные о высокой распространенности цитокератина 6 при плоскоклеточном раке (р< 0,001) и аденокарциноме (р= 0,004) по сравнению с бронхиальным эпителием
    Exact
    [20]
    Suffix
    . Таким образом, цитокератины 5, 6 и 14 могут быть предложены в качестве панели для диагностики РЛ, но должны быть проведены дальнейшие исследования для определения их диагностического значения и роли в патогенезе РЛ.
    (check this in PDF content)

  25. Start
    19345
    Prefix
    Среди белков некератиновой природы, которые были достоверно идентифицированы у 30 % здоровых доноров, следует отметить: простагландин-H2Dизомеразу – медиатор аллергических и воспалительных процессов, который опосредует хемотаксис эозинофилов и базофилов в тканях легких
    Exact
    [21]
    Suffix
    , а также кининоген – ингибитор тиоловых протеаз, играющих важную роль в свертывании крови. В 20 % образцов КВВ здоровых доноров были определены пептиды, характерные для белка COP9 сигналосомы (CSN).
    (check this in PDF content)

  26. Start
    19909
    Prefix
    Ранее у млекопитающих было установлено, что CSN играет важную роль в таких клеточных процессах, как сигнальная трансдукция, прогрессия клеточного цикла, транскрипция генов, выживание клеток и репарация ДНК. CSN функционирует в качестве посредника между клеточными сигналами и положительной регуляцией убиквитин-зависимой деградации белков
    Exact
    [22]
    Suffix
    . Низкий уровень этого белка в КВВ у онкологических больных может быть связан с дисфункцией убиквитиновой защиты в раковых клетках. Некоторые белки были найдены только у отдельных доноров, например изоформа α-цепи фибриногена, цистатин-А и т. д.
    (check this in PDF content)

  27. Start
    20323
    Prefix
    Некоторые белки были найдены только у отдельных доноров, например изоформа α-цепи фибриногена, цистатин-А и т. д. Эти белки являются нормальными участниками обмена веществ, и изменения в их экспрессии могут быть связаны с другими неопухолевыми заболеваниями
    Exact
    [15]
    Suffix
    . В образцах КВВ онкологической группы обнаружено 6 белков: β- и α-субъединицы гемоглобина, изоформы ядерного убиквитинового казеина (NUCKS), изоформы HMG-I – белка группы высокой мобильности HMG-I/HMG-Y и цДНК FLJ78440, сходная с человеческим Lf (рис. 2).
    (check this in PDF content)

  28. Start
    21100
    Prefix
    Белки группы HMG-I/Y изменяют структуру ДНК, облегчая белок-белковые взаимодействия в преинициативном транскрипционном комплексе на аденин-тимин-богатых последовательностях индивидуальных генов. В исследованиях на мышах было показано, что сверхэкспрессия клетками HMG-I/Y белков приводит к онкологической трансформации
    Exact
    [23]
    Suffix
    . Однако молекулярные механизмы, которые обеспечивают сверхэкспрессию белка в раковых клетках, по-прежнему неясны [24]. Известно, что уровень Lf повышается в несколько раз при различных воспалительных заболеваниях.
    (check this in PDF content)

  29. Start
    21227
    Prefix
    В исследованиях на мышах было показано, что сверхэкспрессия клетками HMG-I/Y белков приводит к онкологической трансформации [23]. Однако молекулярные механизмы, которые обеспечивают сверхэкспрессию белка в раковых клетках, по-прежнему неясны
    Exact
    [24]
    Suffix
    . Известно, что уровень Lf повышается в несколько раз при различных воспалительных заболеваниях. Увеличение содержания Lf было обнаружено у пациентов, имеющих хронические гиперплазии, рак различной локализации и лимфопролиферативные заболевания.
    (check this in PDF content)

  30. Start
    21691
    Prefix
    Так, например, у женщин была продемонстрирована сверхэкспрессия белка Lf и матричной РНК в злокачественной аденокарциноме эндометрия по сравнению с нормальными эпителиальными клетками
    Exact
    [25]
    Suffix
    . Таким образом, потенциал оценки уровня Lf в качестве маркера опухоли достаточно убедителен. Среди белков, обнаруживаемых в КВВ у онкологических больных, идентифицирован NUCKS (рис. 3). NUCKS является ядерным ДНК-связывающим белком, который широко экспрессируется и имеет высокие уровни в щитовидной железе, предстательной железе и матке, печени плода, тимусе и легких.
    (check this in PDF content)

  31. Start
    22735
    Prefix
    Недавно P.Ziolkowski et al. проанализировали экспрессию NUCKS в клетках карциномы молочной железы и обнаружили ее высокий уровень при различных поражениях, в т. ч. базальном и плоскоклеточном раке. Авторы предположили, что NUCKS можно использовать в качестве нового потенциального биомаркера злокачественности опухоли
    Exact
    [26]
    Suffix
    . В КВВ у больных (n= 8) был идентифицирован белок гемоглобин. Сравнение клинических характеристик этих пациентов показало более тяжелое течение онкологического заболевания по сравнению с другими больными.
    (check this in PDF content)

  32. Start
    24818
    Prefix
    "молекулярные функции" в группе онкологических больных значимо преобладает такая категория, как функция белков-переносчиков, тогда как каталитическая и молекулярная активность трансдукторов наиболее выражена у больных контрольной группы. Заключение В настоящем исследовании были использованы ранее разработанные подходы для идентификации белков в КВВ у пациентов с РЛ
    Exact
    [13, 14]
    Suffix
    . Показано, что группа кератинов 5, 6 и 14 значительно более выражена при онкопатологии по сравнению с контрольной группой (р< 0,05). Выделена группа из 6 белков, преимущественно детектируемых в КВВ у больных РЛ, а именно – β- и α-субъединицы гемоглобина, изоформы NUCKS, HMG-I белка группы высокой мобильности HMG-I/HMG-Y и цДНК FLJ78440, сходная с человеческим Lf.
    (check this in PDF content)

  33. Start
    25821
    Prefix
    Кроме того, важным шагом является разработка платформы для количественного анализа потенциальных биомаркеров в КВВ для оценки эффективности проводимого медикаментозного лечения, химиотерапии и хирургического вмешательства
    Exact
    [15]
    Suffix
    . Благодарность Авторы выражают благодарность Российскому фонду фундаментальных исследований за поддержку работы (12-08-33089-мол-авед, 13-08-01445-а, 14-08-01236-а, 14-08-31360 мол-а, 14-0831652-мол-а, 13-04-40110-Н-КОМФИ).
    (check this in PDF content)