The 87 reference contexts in paper I. Kudriavtsev V., A. Golovkin S., A. Zurochka V., S. Khaidukov V., И. Кудрявцев В., А. Головкин С., А. Зурочка В., С. Хайдуков В. (2014) “СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ И ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ АПОПТОЗА В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ // MODERN TECHNOLOGIES AND APPROACHES TO APOPTOSIS STUDIES IN EXPERIMENTAL BIOLOGY” / spz:neicon:mimmun:y:2012:i:6:p:461-482

  1. Start
    4006
    Prefix
    Апоптоз – это запрограммированная клеточная гибель. Данный термин был предложен группой английских ученых под руководством Джона Керра в 1972 году для описания процесса гибели лимфоцитов под действием глюкокортикоидов
    Exact
    [35]
    Suffix
    . В дословном переводе он означает «опадание листьев» или «отделение лепестков от цветка», что, применительно к клетке, рассматривается как образование апоптотических телец, формирующихся на терминальных стадиях клеточной гибели.
    (check this in PDF content)

  2. Start
    4778
    Prefix
    Однако, несмотря на столь долгую историю исследований, интерес к механизмам индукции и регуляции процесса программируемой клеточной гибели не ослабевает. Причиной тому служит важнейшая роль этого процесса в различных аспектах функционирования многоклеточных организмов
    Exact
    [21]
    Suffix
    . Помимо элиминации измененных – поврежденных, дефектных, мутантных или инфицированных клеток, посредством апоптоза реализуются процессы дифференцировки и морфогенеза при формировании тканей и органов.
    (check this in PDF content)

  3. Start
    5148
    Prefix
    Помимо элиминации измененных – поврежденных, дефектных, мутантных или инфицированных клеток, посредством апоптоза реализуются процессы дифференцировки и морфогенеза при формировании тканей и органов. Кроме того, осуществляется поддержание клеточного гомеостаза уже сформированного организма, также как и его защита от патогенов при реализации защитных реакций
    Exact
    [65]
    Suffix
    . Следует отметить, что апоптоз, как программируемая клеточная гибель, характерен для всех эукариот, начиная от одноклеточных простейших и заканчивая высшими многоклеточными животными [3, 29, 36].
    (check this in PDF content)

  4. Start
    5338
    Prefix
    Кроме того, осуществляется поддержание клеточного гомеостаза уже сформированного организма, также как и его защита от патогенов при реализации защитных реакций [65]. Следует отметить, что апоптоз, как программируемая клеточная гибель, характерен для всех эукариот, начиная от одноклеточных простейших и заканчивая высшими многоклеточными животными
    Exact
    [3, 29, 36]
    Suffix
    . У большинства эукариот в развитии апоптоза традиционно выделяют три стадии: сигнальную или индукционную, эффекторную и терминальную или деградационную. Среди морфологических изменений, имеющих место в апоптотозирующей клетке, большинство исследователей выделяет следующие [66, 72, 73]: – изменение формы клетки, обычно, клетка приобретает шарообразную форму; – потеря поверхностных структур –
    (check this in PDF content)

  5. Start
    5624
    Prefix
    У большинства эукариот в развитии апоптоза традиционно выделяют три стадии: сигнальную или индукционную, эффекторную и терминальную или деградационную. Среди морфологических изменений, имеющих место в апоптотозирующей клетке, большинство исследователей выделяет следующие
    Exact
    [66, 72, 73]
    Suffix
    : – изменение формы клетки, обычно, клетка приобретает шарообразную форму; – потеря поверхностных структур – микровиллей, псевдоподий и т.д.; – изменение объема клетки (в зависимости от фазы апоптоза); – конденсация хроматина в ядре и диссоциация ядрышек; – фрагментация ядра, конденсация цитоплазмы и формирование «апоптотических» телец на поздних стадиях апоптоза для облегчения фагоцитоза и т.д
    (check this in PDF content)

  6. Start
    7720
    Prefix
    Оценка морфометрических характеристик клеток при апоптозе Для изучения морфологических изменений при апоптозе определяют параметры прямого (светорассеяние, измеряемое под углом 1-19°) и бокового светорассеяния (светорассеяние, измеряемое под углом 90°), характеризующие размер и структуру клетки
    Exact
    [67]
    Suffix
    . При запуске апоптоза объем цитоплазмы клетки постепенно уменьшается, что приводит к снижению интенсивности прямого светорассеяния. Одновременно в клетке начинается конденсация хроматина и формирование его скоплений около ядерной мембраны, после чего на последней появляются инвагинации и, в итоге, происходит фрагментация ядра с формированием так называемых «апоптотических телец».
    (check this in PDF content)

  7. Start
    8948
    Prefix
    Примеры подобного рода исследований приведены на рисунке 1. Следует отметить, что подобные методы оценки апоптоза в подавляющем числе случаев себя хорошо зарекомендовали при работе с суспензионными клеточными культурами, например, с клетками линии HL-60
    Exact
    [14]
    Suffix
    или клетками лимфомы Беркитта [19]. Однако вопрос о целесообразности применения такого подхода при работе с циркулирующими клетками беспозвоночных, обладающих высокой адгезивной активностью, остается до настоящего времени открытым.
    (check this in PDF content)

  8. Start
    8984
    Prefix
    Следует отметить, что подобные методы оценки апоптоза в подавляющем числе случаев себя хорошо зарекомендовали при работе с суспензионными клеточными культурами, например, с клетками линии HL-60 [14] или клетками лимфомы Беркитта
    Exact
    [19]
    Suffix
    . Однако вопрос о целесообразности применения такого подхода при работе с циркулирующими клетками беспозвоночных, обладающих высокой адгезивной активностью, остается до настоящего времени открытым.
    (check this in PDF content)

  9. Start
    9789
    Prefix
    Каспазы (от англ. caspases – cysteinyl aspartate-specific proteases) – это семейство внутриклеточных цистеиновых протеаз, которые расщепляют аминокислотные последовательности белков-мишеней после остатка аспарагиновой кислоты
    Exact
    [10]
    Suffix
    . Отличительной особенностью семейства каспаз является наличие консервативной последовательности в составе активного центра – пентапептида QACXG (где Х – остаток аргинина, глютамина или глицина).
    (check this in PDF content)

  10. Start
    11072
    Prefix
    У различных представителей млекопитающих описано 15 генов, кодирующих каспазы, из которых ферменты с порядковыми номерами 1, 4, 5, 11 и 13 не принимают участие в запуске и реализации программируемой клеточной гибели
    Exact
    [17]
    Suffix
    . Оставшиеся каспазы подразделяют на инициирующие (каспаза-2, -8, -9, -10 и -12) и эффекторные (каспазы-3, -6 и -7). Отличительной чертой инициирующих каспаз является наличие сложно организованного продомена, на котором располагаются сайты, отвечающие за распознавание и взаимодействие Рисунок 1.
    (check this in PDF content)

  11. Start
    11566
    Prefix
    Отличительной чертой инициирующих каспаз является наличие сложно организованного продомена, на котором располагаются сайты, отвечающие за распознавание и взаимодействие Рисунок 1. Анализ морфометрических характеристик клеток при апоптозе Примечание. Гистограммы А и В – клетки В-клеточной лимфомы, инкубация которых проходила в отсутствие (А) и присутствии (В) НА14-1 (из
    Exact
    [67]
    Suffix
    ); гистограммы С и D – клетки линии Jurkat поле 24-часовой инкубаций в отсутствии (С) или присутствии антител к CD95 (из [64]). V – живые клетки, АР – клетки, вступившие в апоптоз; LA/N – клетки на стадии позднего апоптоза/некроза; DВ – клеточный дебрис.
    (check this in PDF content)

  12. Start
    11691
    Prefix
    Гистограммы А и В – клетки В-клеточной лимфомы, инкубация которых проходила в отсутствие (А) и присутствии (В) НА14-1 (из [67]); гистограммы С и D – клетки линии Jurkat поле 24-часовой инкубаций в отсутствии (С) или присутствии антител к CD95 (из
    Exact
    [64]
    Suffix
    ). V – живые клетки, АР – клетки, вступившие в апоптоз; LA/N – клетки на стадии позднего апоптоза/некроза; DВ – клеточный дебрис. Малоугловое светорассеяние А C B D с регуляторными белками, следствием такого взаимодействия является активация эффекторных прокаспаз [57].
    (check this in PDF content)

  13. Start
    12022
    Prefix
    V – живые клетки, АР – клетки, вступившие в апоптоз; LA/N – клетки на стадии позднего апоптоза/некроза; DВ – клеточный дебрис. Малоугловое светорассеяние А C B D с регуляторными белками, следствием такого взаимодействия является активация эффекторных прокаспаз
    Exact
    [57]
    Suffix
    . Так, в случае рецептор-зависимого пути запуска апоптоза ключевая роль отводится активации инициирующей каспазы-8, в составе продомена которой имеются повторы DED для взаимодействия с белком FADD.
    (check this in PDF content)

  14. Start
    12586
    Prefix
    При митохондриальном сигнальном пути индукции апоптоза ключевое место отводится каспазе-9, в составе которой находится домен CARD, отвечающий за связывание с аналогичным доменом белка APAF-1, что, в конечном итоге, приводит к формированию апоптосомы. Следует отметить, что оба эти пути направлены на активацию каспазы-3 – одной из основных эффекторных каспаз
    Exact
    [24]
    Suffix
    . К основным мишеням последних относятся белки и ферменты, отвечающие за фрагментацию ДНК (каспазазависимые эндонуклеазы, PARP), сохранение целостности ядерной мембраны (ламины А, В и С), целостность цитоскелета клетки (актин, фодрин), передачу внутриклеточных сигналов (некоторые изоформы протеинкиназы С и др.), а также белки-ингибиторы апоптоза (например, антиапоптотические белки семейства b
    (check this in PDF content)

  15. Start
    14122
    Prefix
    Отличительной особенность FLICA является низкая токсичность и способность спонтанно диффундировать через мембрану клеток, что позволяет избегать длительной и трудоемкой процедуры пробоподготовки, как это имеет место в случае использования моноклональных антител при исследовании активности каспаз при помощи моноклональных антител
    Exact
    [40]
    Suffix
    . Способность к избирательному взаимодействию соединений типа FLICA с каспазами обусловлена строением молекул [66]. FLICA состоят из трех основных частей: флюорохрома (это либо карбоксифлюоресцеин – FAM, либо флюоресцеин – FITC, или сульфородамина – SR), сайта из четырех аминокислот для взаимодействия со специфической каспазой, а также хлоро- или сульфометил кетона (CMK или FMK, соответственн
    (check this in PDF content)

  16. Start
    14237
    Prefix
    и способность спонтанно диффундировать через мембрану клеток, что позволяет избегать длительной и трудоемкой процедуры пробоподготовки, как это имеет место в случае использования моноклональных антител при исследовании активности каспаз при помощи моноклональных антител [40]. Способность к избирательному взаимодействию соединений типа FLICA с каспазами обусловлена строением молекул
    Exact
    [66]
    Suffix
    . FLICA состоят из трех основных частей: флюорохрома (это либо карбоксифлюоресцеин – FAM, либо флюоресцеин – FITC, или сульфородамина – SR), сайта из четырех аминокислот для взаимодействия со специфической каспазой, а также хлоро- или сульфометил кетона (CMK или FMK, соответственно).
    (check this in PDF content)

  17. Start
    15440
    Prefix
    После взаимодействия FLICA с остатком цистеина активного центра каспазы формируются комплексы, не способные к диффузии из клетки, тем самым происходит накопление этих ингибиторов каспаз в апоптотических клетках. Так как в составе молекулы FLICA входит флюоресцирующий фрагмент, то это позволяет отличить апоптозирующие – флюоресцирующие – клетки от живых
    Exact
    [53]
    Suffix
    . Иногда по завершении инкубации образца с FLICA добавляют дополнительные агенты, применяемые для изучения апоптоза и позволяющие повысить информативность исследований, например, аннексин V. Так, применение подобной комбинированной окраски клеток позволило доказать, что активация каскада каспаз предшествует изменению липидного состава цитоплазматической мембраны [53].
    (check this in PDF content)

  18. Start
    15814
    Prefix
    Иногда по завершении инкубации образца с FLICA добавляют дополнительные агенты, применяемые для изучения апоптоза и позволяющие повысить информативность исследований, например, аннексин V. Так, применение подобной комбинированной окраски клеток позволило доказать, что активация каскада каспаз предшествует изменению липидного состава цитоплазматической мембраны
    Exact
    [53]
    Suffix
    . Для исследования более поздних стадий апоптоза применяют комбинированную окраску FAM-VAD-FMK и ДНК-связывающими красителями, например, PI, как это приведено на рисунке 2. В силу своей универсальности аннексин V нашел широкое применение и в сравнительноиммунологических исследованиях.
    (check this in PDF content)

  19. Start
    16248
    Prefix
    В силу своей универсальности аннексин V нашел широкое применение и в сравнительноиммунологических исследованиях. В настоящее время целый ряд представителей семейства каспаз описан у большинства групп животных, к числу которых относятся кишечнополостные
    Exact
    [38]
    Suffix
    , членистоногие [12], моллюски [71] и иглокожие [55]. Однако из-за отсутствия препаратов антител, конъюгированных с флюорохромами, методы определения каспаз не нашли широкого применения в сравнительно-иммунологических исследования у представителей данных групп животных.
    (check this in PDF content)

  20. Start
    16268
    Prefix
    В силу своей универсальности аннексин V нашел широкое применение и в сравнительноиммунологических исследованиях. В настоящее время целый ряд представителей семейства каспаз описан у большинства групп животных, к числу которых относятся кишечнополостные [38], членистоногие
    Exact
    [12]
    Suffix
    , моллюски [71] и иглокожие [55]. Однако из-за отсутствия препаратов антител, конъюгированных с флюорохромами, методы определения каспаз не нашли широкого применения в сравнительно-иммунологических исследования у представителей данных групп животных.
    (check this in PDF content)

  21. Start
    16283
    Prefix
    В силу своей универсальности аннексин V нашел широкое применение и в сравнительноиммунологических исследованиях. В настоящее время целый ряд представителей семейства каспаз описан у большинства групп животных, к числу которых относятся кишечнополостные [38], членистоногие [12], моллюски
    Exact
    [71]
    Suffix
    и иглокожие [55]. Однако из-за отсутствия препаратов антител, конъюгированных с флюорохромами, методы определения каспаз не нашли широкого применения в сравнительно-иммунологических исследования у представителей данных групп животных.
    (check this in PDF content)

  22. Start
    16301
    Prefix
    В силу своей универсальности аннексин V нашел широкое применение и в сравнительноиммунологических исследованиях. В настоящее время целый ряд представителей семейства каспаз описан у большинства групп животных, к числу которых относятся кишечнополостные [38], членистоногие [12], моллюски [71] и иглокожие
    Exact
    [55]
    Suffix
    . Однако из-за отсутствия препаратов антител, конъюгированных с флюорохромами, методы определения каспаз не нашли широкого применения в сравнительно-иммунологических исследования у представителей данных групп животных.
    (check this in PDF content)

  23. Start
    16727
    Prefix
    Так, в литературе встречается одиночные упоминания об использовании FAM-VADFMK в рамках экспериментов по индукции апоптоза ионами цинка в гемоцитах насекомых Musca domestica и Drosophila melanogaster
    Exact
    [27]
    Suffix
    . Исследование асимметрии плазматической мембраны клеток при помощи аннексина V, конъюгированного с флюоресцентными красителями Еще одним универсальным методом исследования апоптоза является анализ липидного состава плазматической мембраны клеток.
    (check this in PDF content)

  24. Start
    18307
    Prefix
    Запуск апоптоза, сопровождающийся снижением концентрации АТФ внутри клетки, вызывает изменения в работе широкого спектра внутриклеточных ферментов, что и сказывается на нарушении асимметрии клеточной мембраны апоптотирующей клетки
    Exact
    [63]
    Suffix
    . В поверхностном слое мембраны апоптотических клеток в большем, по сравнению с живыми клетками, количестве появляются молекулы фосфатидилсерина. Кроме того, существенную роль в данном процессе может играть фермент под названием скрамблаза, отвечающий за перенос отрицательно заряженных липидов из внутреннего липидного слоя мембраны во внешний.
    (check this in PDF content)

  25. Start
    19084
    Prefix
    Биологический смысл экстернализации – появления в наружном слое – фосфатидилсерина очень прост и логичен, так как данный липид распознается рецепторами макрофагов, что приводит к быстрому удалению из тканей как клеток, вступивших на путь апоптоза, так и сформировавшихся апоптотических телец при помощи фагоцитоза
    Exact
    [18]
    Suffix
    . В проточной цитофлюориметрии для исследования асимметрии мембраны апоптозирующих клеток, а именно для выявления фосфатидилсерина, используют конъюгаты аннексина V с различными флюорохромами (обычно FITC или РЕ).
    (check this in PDF content)

  26. Start
    19533
    Prefix
    Аннексин V, также известный как аннексин А5 или плацентарный антикоагулянтный протеин, является глиткопротеином семейства аннексинов с молекулярной массой около 35-36 Рисунок 2. Изучение активности каспаз при индукции апоптоза
    Exact
    [66]
    Suffix
    Примечание. Гистограмма А – контроль, гистограммы В – индукция апоптоза брефельдином А в клетках В-клеточной лимфомы. По оси абсцисс – интенсивность флюоресценции FAM-VAD-FMK, зеленая часть спектра; по оси ординат – интенсивность флюоресценции PI.
    (check this in PDF content)

  27. Start
    20800
    Prefix
    Некоторые исследователи считают, что благодаря экранированию аннексином V фосфатидилсерина на поверхности гибнущих клеток и апоптотических телец происходит снижение прокоагулярой и провоспалительной активности последних
    Exact
    [7]
    Suffix
    . Следует отметить, что процессы, связанные с изменением мембранного потенциала митохондрий и активацией каспазы-3, предшествуют появлению фосфатидилсерина во внешнем слое мембраны, а перестройка цитоскелета клетки и нарушение целостности мембраны происходят несколько позднее.
    (check this in PDF content)

  28. Start
    21266
    Prefix
    потенциала митохондрий и активацией каспазы-3, предшествуют появлению фосфатидилсерина во внешнем слое мембраны, а перестройка цитоскелета клетки и нарушение целостности мембраны происходят несколько позднее. Именно поэтому существует множество вариантов комбинирования окраски клеток аннексином V и другими маркерами, направленными на выявления как ранних, так и более поздних фаз апоптоза
    Exact
    [67]
    Suffix
    . В настоящее время наиболее распространенным и широко применяемым методом исследование апоптоза является окрашивание клеток при помощи аннексина V, конъюгированного с FITC, и красителей ДНК (обычно PI или 7-AAD).
    (check this in PDF content)

  29. Start
    21630
    Prefix
    В настоящее время наиболее распространенным и широко применяемым методом исследование апоптоза является окрашивание клеток при помощи аннексина V, конъюгированного с FITC, и красителей ДНК (обычно PI или 7-AAD). Эта методика нашла применение в сравнительно-иммунологических исследованиях на весьма широком круге объектов, к числу которых относятся губки
    Exact
    [33]
    Suffix
    , различные виды насекомых [27, 45], моллюски [5, 56], колониальные асцидии Botryllus schlosseri [11], не говоря уже о представителях позвоночных животных [23]. Принцип этого метода заключается в следующем.
    (check this in PDF content)

  30. Start
    21661
    Prefix
    В настоящее время наиболее распространенным и широко применяемым методом исследование апоптоза является окрашивание клеток при помощи аннексина V, конъюгированного с FITC, и красителей ДНК (обычно PI или 7-AAD). Эта методика нашла применение в сравнительно-иммунологических исследованиях на весьма широком круге объектов, к числу которых относятся губки [33], различные виды насекомых
    Exact
    [27, 45]
    Suffix
    , моллюски [5, 56], колониальные асцидии Botryllus schlosseri [11], не говоря уже о представителях позвоночных животных [23]. Принцип этого метода заключается в следующем. В нормальных живых клетках на поверхностной мембране фосфотидилсерин представлен в минимальном количестве, поэтому взаимодействие аннексина V с клетками незначительно.
    (check this in PDF content)

  31. Start
    21680
    Prefix
    время наиболее распространенным и широко применяемым методом исследование апоптоза является окрашивание клеток при помощи аннексина V, конъюгированного с FITC, и красителей ДНК (обычно PI или 7-AAD). Эта методика нашла применение в сравнительно-иммунологических исследованиях на весьма широком круге объектов, к числу которых относятся губки [33], различные виды насекомых [27, 45], моллюски
    Exact
    [5, 56]
    Suffix
    , колониальные асцидии Botryllus schlosseri [11], не говоря уже о представителях позвоночных животных [23]. Принцип этого метода заключается в следующем. В нормальных живых клетках на поверхностной мембране фосфотидилсерин представлен в минимальном количестве, поэтому взаимодействие аннексина V с клетками незначительно.
    (check this in PDF content)

  32. Start
    21731
    Prefix
    Эта методика нашла применение в сравнительно-иммунологических исследованиях на весьма широком круге объектов, к числу которых относятся губки [33], различные виды насекомых [27, 45], моллюски [5, 56], колониальные асцидии Botryllus schlosseri
    Exact
    [11]
    Suffix
    , не говоря уже о представителях позвоночных животных [23]. Принцип этого метода заключается в следующем. В нормальных живых клетках на поверхностной мембране фосфотидилсерин представлен в минимальном количестве, поэтому взаимодействие аннексина V с клетками незначительно.
    (check this in PDF content)

  33. Start
    21790
    Prefix
    Эта методика нашла применение в сравнительно-иммунологических исследованиях на весьма широком круге объектов, к числу которых относятся губки [33], различные виды насекомых [27, 45], моллюски [5, 56], колониальные асцидии Botryllus schlosseri [11], не говоря уже о представителях позвоночных животных
    Exact
    [23]
    Suffix
    . Принцип этого метода заключается в следующем. В нормальных живых клетках на поверхностной мембране фосфотидилсерин представлен в минимальном количестве, поэтому взаимодействие аннексина V с клетками незначительно.
    (check this in PDF content)

  34. Start
    25849
    Prefix
    Снижение числа апоптотических клеток может быть вызвано отсутствием в среде для постановки реакции двухвалентных катионов кальция, так как взаимодействие аннексина V с фосфотидилсерином является кальций-зависимым процессом. Поэтому в пробы следует добавлять «связывающий буфер» следующего состава: 10 mM HEPES, 140 mM NaCl и 3,3 mM CaCl2
    Exact
    [5]
    Suffix
    или 140 mM NaCl, 5 mM CaCl2 и 10mM HEPES [23]. Также необходимо помнить, что осмотичность среды для постановки реакции и ее рН должны соответствовать физиологическим значениям для каждого конкретного типа живых организмов.
    (check this in PDF content)

  35. Start
    25894
    Prefix
    Снижение числа апоптотических клеток может быть вызвано отсутствием в среде для постановки реакции двухвалентных катионов кальция, так как взаимодействие аннексина V с фосфотидилсерином является кальций-зависимым процессом. Поэтому в пробы следует добавлять «связывающий буфер» следующего состава: 10 mM HEPES, 140 mM NaCl и 3,3 mM CaCl2 [5] или 140 mM NaCl, 5 mM CaCl2 и 10mM HEPES
    Exact
    [23]
    Suffix
    . Также необходимо помнить, что осмотичность среды для постановки реакции и ее рН должны соответствовать физиологическим значениям для каждого конкретного типа живых организмов. При использовании для постановки реакции коммерческих наборов данный буфер входит в комплект набора «по умолчанию», и его применение рассчитано для постановки реакции с клетками млекопитающих.
    (check this in PDF content)

  36. Start
    26453
    Prefix
    При использовании для постановки реакции коммерческих наборов данный буфер входит в комплект набора «по умолчанию», и его применение рассчитано для постановки реакции с клетками млекопитающих. Описанная выше методика были использована в экспериментах с гемоцитами мидии Mytilus galloprovincialis для оценки влияния фактора некроза опухолей α (TNFα) на жизнеспособность клеток
    Exact
    [5]
    Suffix
    . Существенным преимуществом применения аннексина V, конъюгированного с флюорохромами, при изучении апоптоза является возможность комбинировать этого красителя с моноклональными антителами. Так, этот подход был применен для определения уровня апоптоза В-лимфоцитов, в рамках исследования влияния температурного стресса на эффективность функционирования системы приобретенного иммунитета обыкнове
    (check this in PDF content)

  37. Start
    26884
    Prefix
    Так, этот подход был применен для определения уровня апоптоза В-лимфоцитов, в рамках исследования влияния температурного стресса на эффективность функционирования системы приобретенного иммунитета обыкновенного карпа Cyprinus carpio
    Exact
    [23]
    Suffix
    . Результаты одного из экспериментов приведены на рисунке 3. Изучение функций митохондрий при апоптозе методом проточной цитофлюориметрии Нарушение функций митохондрий клетки является еще одним универсальным признаком апоптоза, характерным для эукариотических организмов [1].
    (check this in PDF content)

  38. Start
    27159
    Prefix
    Изучение функций митохондрий при апоптозе методом проточной цитофлюориметрии Нарушение функций митохондрий клетки является еще одним универсальным признаком апоптоза, характерным для эукариотических организмов
    Exact
    [1]
    Suffix
    . В результате этого происходит высвобождению в цитоплазму проапототических факторов – цитохром с, AIF (apoptosis inducing factor – «фактор индуцирующий апоптоз»), Smac/DIABLO, эндонуклеазы G, а также проформ каспаз 2, 3 и 9 – индуцирующих каскад каспаз [50].
    (check this in PDF content)

  39. Start
    27418
    Prefix
    В результате этого происходит высвобождению в цитоплазму проапототических факторов – цитохром с, AIF (apoptosis inducing factor – «фактор индуцирующий апоптоз»), Smac/DIABLO, эндонуклеазы G, а также проформ каспаз 2, 3 и 9 – индуцирующих каскад каспаз
    Exact
    [50]
    Suffix
    . Выход этих белков может реализоваться как за счет разрыва митохондриальных мембран, так и за счет активации специфических каналов во внешней мембране митохондрий. Любое из приведенных выше событий сопровождается изменением проницаемости внутренней мембраны митохондрий для протонов Н+, что и приводит к изменению мембранного потенциала митохондрий (ΔΨm).
    (check this in PDF content)

  40. Start
    28328
    Prefix
    Принцип работы этих красителей очень прост – липофильные зонды спонтанно проникают через билипидные мембраны (поверхностную мембрану клетки, а также внешнюю и внутреннюю мембраны митохондрий) и накапливаются в областях с высокой Рисунок 3. Влияние температурного стресса уровень апоптоза в лимфоцитах обыкновенного карпа C. carpio
    Exact
    [23]
    Suffix
    Примечание. Гистограмма А – образец контрольной группы; гистограмма В – образец экспериментальной группы (4 часа холодового шока). По оси абсцисс – интенсивность флюоресценции AnnV-FITC; по оси ординат – интенсивность флюоресценции WCI 12 антител мыши против H-целей иммуноглобулина М карпа, выявленных при помощи конъюгированных с РЕ антител козы против мыши.
    (check this in PDF content)

  41. Start
    29776
    Prefix
    Тем самым исследователь может отличить интактные клетки с эффективно функционирующими митохондриями (и, как следствие, высокой интенсивностью флюоресценции), от гибнущих или мертвых клеток, в которых функционирование митохондрий нарушено. Как следствие, такие клетки обладают пониженной интенсивностью флюоресценции
    Exact
    [13]
    Suffix
    . Большинство используемых красителей, в зависимости от химической природы, относятся к трем основным группам соединений: родаминовые (родамин 123 (Rh123), этиловый (TMRE) и метиловый (TMRM) эфиры тетраметилродамина), карбоцианиновые (5,5’-6,6’-тетрахлоро-1,1’,3,3’тетраэтилбензамидазолкарбоцианин (JC-1), йодистый 3,3’-диметил-α-нафтоксакарбоцианина (JC-9), йодид 3,3’-дигексилоксакарбоцианина –
    (check this in PDF content)

  42. Start
    30904
    Prefix
    При снижении ΔΨm наблюдается снижении интенсивности флюоресценции этих красителей, что и позволяет отличить живые клетки от клеток, в которых произошел запуск апоптоза. Родамин 123 (Rh123) был самым первым флюоресцентным красителем, примененным для окрашивания митохондрий живых клеток
    Exact
    [34]
    Suffix
    . Благодаря своим липофильным свойствам Rh123 спонтанно диффундирует через плазматическую мембрану клетки, а наличие катионных свойств помогает ему преимущественно накапливаться в эффективно функционирующих митохондриях, несущих заряд на своей внутренней мембране.
    (check this in PDF content)

  43. Start
    32472
    Prefix
    Подобный подход позволяет выделить живые клетки с функционирующими митохондриями по интенсивному свечению Rh123 и целостТАблИцА 1. КРАсИТелИ, ПРИменяемые для ИсследоВАнИя мембРАнного ПоТенцИАлА мИТохондРИй
    Exact
    [13]
    Suffix
    КрасительМаксимум возбуждения, нмМаксимум испускания, нм DiOC6(3)484501 Родамин 123507529 JC-1514529 (мономеры) 590 (J-агрегаты) JC-9522535 (мономеры) 635 (J-агрегаты) TMRE549574 TMRM548573 RedoxSensor Red CC-1540600 MitoTracker CMXRos551576 MitoFluor Red 584604637 ной поверхностной мембраной, непроницаемой для PI.
    (check this in PDF content)

  44. Start
    33234
    Prefix
    Клетки, находящиеся на ранних стадиях апоптоза, будут негативны по обоим красителям (мембранный потенциал митохондрий нарушен, но поверхностная мембрана еще сохраняет свою целостность), а при позднем апоптозе и некрозе клетки будут окрашиваться только PI. Широкое применение этот метод находит и в работах на низших позвоночных и беспозвоночных животных – морских ежах Anthocidaris crassispina
    Exact
    [44]
    Suffix
    , представителях двустворчатых и брюхоногих моллюсков [2], а также костных рыбах Oncorhynchus mykiss [4]. Примером подобного рода исследования может служить работа Lu и Wu (2005), посвященная изучению влияния ультрафиолетового излучения на жизнеспособность сперматозоидов морского ежа A. crassispina [44].
    (check this in PDF content)

  45. Start
    33292
    Prefix
    Широкое применение этот метод находит и в работах на низших позвоночных и беспозвоночных животных – морских ежах Anthocidaris crassispina [44], представителях двустворчатых и брюхоногих моллюсков
    Exact
    [2]
    Suffix
    , а также костных рыбах Oncorhynchus mykiss [4]. Примером подобного рода исследования может служить работа Lu и Wu (2005), посвященная изучению влияния ультрафиолетового излучения на жизнеспособность сперматозоидов морского ежа A. crassispina [44].
    (check this in PDF content)

  46. Start
    33339
    Prefix
    Широкое применение этот метод находит и в работах на низших позвоночных и беспозвоночных животных – морских ежах Anthocidaris crassispina [44], представителях двустворчатых и брюхоногих моллюсков [2], а также костных рыбах Oncorhynchus mykiss
    Exact
    [4]
    Suffix
    . Примером подобного рода исследования может служить работа Lu и Wu (2005), посвященная изучению влияния ультрафиолетового излучения на жизнеспособность сперматозоидов морского ежа A. crassispina [44].
    (check this in PDF content)

  47. Start
    33540
    Prefix
    Примером подобного рода исследования может служить работа Lu и Wu (2005), посвященная изучению влияния ультрафиолетового излучения на жизнеспособность сперматозоидов морского ежа A. crassispina
    Exact
    [44]
    Suffix
    . Результаты анализа контрольной и экспериментальной проб приведены на рисунке 4. Особенностью DiOC6(3) является и то, что для исследования функций митохондрий его следует применять в низких, по сравнению с Rh123, концентрациях (10-20 нМ), так как в концентрациях свыше 50 нМ он спонтанно связывается с мембранами клеток и компонентами эндоплазматической сети.
    (check this in PDF content)

  48. Start
    34217
    Prefix
    Кроме того, его лучше использовать для исследования гомогенных клеточных популяций, так как на интенсивность окраски митохондрий влияет как соотношение клетки/ краситель, так и физиологическое состояние клеток и т.п. Данный краситель был использован для работ на циркулирующих гемоцитах устрицы Ostrea edulis
    Exact
    [54]
    Suffix
    . При постановке экспериментов DiOC6(3) вносили к суспензии гемоцитов в финальной концентрации 2 мкМ, и после 5 минутной инкубации проводили анализ в проточном цитофлюориметре. С использованием данного красителя авторам удалось выделить три популяции гемоцитов моллюска (рис. 5).
    (check this in PDF content)

  49. Start
    34853
    Prefix
    Малые гиалиноциты, характеризовались низким значением флюоресценции красителя DiOC6(3) и низкими значениями параметров прямого и бокового светорассеяния (область R1 на гистограмме А). Большие гиалиноциты, имевшие промежуточные значения Рисунок 4. Влияние ультрафиолетового излучения на жизнеспособность сперматозоидов морского ежа A. crassispina
    Exact
    [44]
    Suffix
    Примечание. Гистограмма А – контроль, гистограмма В – сперматозоиды, подвергнутые ультрафиолетовому облучению мощностью 27 кДжм-2 на протяжении получаса. По оси абсцисс – интенсивность флюоресценции PI, по оси ординат – интенсивность флюоресценции родамина 123.
    (check this in PDF content)

  50. Start
    35448
    Prefix
    Область 1 – живые клетки, область 3 – ранний апоптоз клеток, область 4 – поздний апоптоз/некроз клеток. интенсивность флюоресценции йодистого пропидия 100101103104102100101103104102 100 101 103 102 104 АB 12 3 4 12 3 4 Рисунок 5. Исследование мембранного потенциала митохондрий гемоцитов устрицы O. edulis
    Exact
    [54]
    Suffix
    Примечание. Гистограмма А: по оси абсцисс – интенсивность флюоресценции DiOC6(3); по оси ординат – количество клеток. R1, R2 и R3 – популяции клеток, обладающие различной интенсивностью флюоресценции по DiOC6(3).
    (check this in PDF content)

  51. Start
    38396
    Prefix
    Следовательно, при анализе с использованием проточного цитофлюориметра в апототизирующих клетках максимум эмиссии JC-1 будет смеРисунок 6. Исследование мембранного потенциала митохондрий при помощи красителей JC-9 и TMRM в клетках В-клеточной лимфомы человека
    Exact
    [66, 67]
    Suffix
    Примечание. Гистограммы А и B: по оси абсцисс – интенсивность флюоресценции J-мономеров; по оси ординат – интенсивность флюоресценции J-агрегатов. Гистограмма А – контрольная проба; гистограмма В – индукция апоптоза при помощи анти-CD95 антител.
    (check this in PDF content)

  52. Start
    39530
    Prefix
    101 103 102 104 100101103102104100101103102104 100 101 103 102 104 100 101 103 102 104 100 101 103 102 104 0102310230 щаться от красной области спектра к его зеленой части, как это показано на рисунке 6. Именно это свойство красителя было использовано при исследовании способности фомезафена, применяемого в качестве гербицида, вызывать апоптоз гемоцитов брюхоногого моллюска Lymnaea stagnalis
    Exact
    [58]
    Suffix
    . Отдельного внимания заслуживают липофильные родаминовые соединения TMRE и TMRM. Они способны спонтанно проникать через поверхностную мембрану клеток и специфически накапливаться в поляризованных мембранах митохондрий, а не других органеллах клетки.
    (check this in PDF content)

  53. Start
    40890
    Prefix
    мембранного потенциала митохондрий происходит изменение морфологических параметров исследуемых клеток (в данном случае – снижение интенсивности прямого светорассеяния, характеризующего размер исследуемых клеток). Краситель TMRM в финальной концентрации 40 нМ был применен для изучения влияния наночастиц углерода на жизнеспособность гемоцитов двустворчатого моллюска M. galloprovincialis
    Exact
    [8]
    Suffix
    . Было показано, что частицы в максимальной концентрации 10 мкг/мл вызывали снижение мембранного потенциала митохондрий гемоцитов, что трактовалось авторами как проявления токсического эффекта препарата.
    (check this in PDF content)

  54. Start
    42956
    Prefix
    под внутреннюю мембрану митохондрий этот краситель способен выборочно взаимодействовать с остатками цистеина в составе митохондриальных белков, в результате чего переходит во флюоресцирующую форму с максимумом эмиссии в зеленой области спектра. Аналогичным свойством обладают и остальные красители группы MitoTracker, интенсивТАблИцА 2. КРАсИТелИ, ПРИменяемые для ИсследоВАнИя мИТохондРИй
    Exact
    [13]
    Suffix
    КрасительМаксимум возбуждения, нм Максимум испускания, нм Лиганды MitoTracker Green MT490516 Свободные тиольный группы остатков цистеина MitoFluor Green489517аналогично Nonyl Actidine Orange495519кардиолипин MitoFluor Red 589588622неизвестно MitoTracker Red 580581644Хлорометильные группы MitoTracker Deep Red 633аминокислотных остатков644665 Mito-ID Red558690кардиолипин ность флюоресценции кот
    (check this in PDF content)

  55. Start
    43798
    Prefix
    Следует отметить, что применение красителей, обладающих флюоресценцией в красной части спектра (MitoTracker Red и Deep Red), позволяет их комбинировать с другими флюоресцентными зондами. Так, например, комбинация кальциевых и ДНК-«зондов» с рН-чувствительными красителями, позволяет существенно повысить информативность научных исследований
    Exact
    [26]
    Suffix
    . Комбинированная окраска клеток витальными красителями и ДНК-флюорохромами для исследования жизнеспособности и апоптоза Одним из следствий запуска апоптоза в клетке является снижением активности внутриклеточных ферментов.
    (check this in PDF content)

  56. Start
    46117
    Prefix
    Примером может служить работа по изучению влияния живых и термоинактивированных Bonamia ostreae (высокоспециализированных внутриклеточный паразит устриц) на жизнеспособность гемоцитов устрицы Ostrea edulis
    Exact
    [48]
    Suffix
    . Однако чаще всего эти красители используются совместно с ДНК-связывающими флюорохромами. Так, альтернативой методике исследования апоптоза с применением аннексина V и PI, может служить метод, основанный на одновременной окраске клеток диацетатом флюоресцеина (FDA) и PI.
    (check this in PDF content)

  57. Start
    46755
    Prefix
    FDA, находящийся в форме диэфира, не обладает способностью испускать флюоресценцию, но, благодаря липофильным свойствам, способен спонтанно диффундировать через клеточную мембрану. В цитозоле клеток FDA подвергается воздействию неспецифических эстераз, котоТАблИцА 3. ФлюоРесценТные КРАсИТелИ, ПРИменяемые для оПРеделенИя АКТИВносТИ ВнуТРИКлеТочных эсТеРАз
    Exact
    [48, 60 ,67]
    Suffix
    КрасительДлина волны возбуждения, нм Длина волны испускания, нм Кальцеин АМ495515 Фиолетовый кальцеин АМ408450 Голубой кальцеин АМ360445 Красно-оранжевый кальцеин АМ576589 BCECF AM490535 Флюоресцеин диацетат (FDA)494518 Карбоксифлюоресцеин диацетат (CFDA)~490535 CellTracker Green CMFDA492517 Карбоксинафтофлюоресцеин диацетат598668 рые отщепляют от него гидроксильные группы.
    (check this in PDF content)

  58. Start
    49388
    Prefix
    Тогда как погибшие клетки с нарушенной цитоплазматической мембраной будут негативны по FDA, но будут окрашены PI. В сравнительноиммунологических исследования данный метод чаще всего применятся для изучения процессов апоптоза у представителей костных рыб: обыкновенного карпа C.carpio
    Exact
    [60, 61]
    Suffix
    , королевской дорады Sparus aurata [62] и глазчатой рыбы-собаки Takifugu rubripes [59]. Впервые для низших позвоночных животных этот метод был применен Saha и соавторами для оценки способности различных стероидных гормонов запускать апоптоз в лейкоцитах карпа [60].
    (check this in PDF content)

  59. Start
    49432
    Prefix
    В сравнительноиммунологических исследования данный метод чаще всего применятся для изучения процессов апоптоза у представителей костных рыб: обыкновенного карпа C.carpio [60, 61], королевской дорады Sparus aurata
    Exact
    [62]
    Suffix
    и глазчатой рыбы-собаки Takifugu rubripes [59]. Впервые для низших позвоночных животных этот метод был применен Saha и соавторами для оценки способности различных стероидных гормонов запускать апоптоз в лейкоцитах карпа [60].
    (check this in PDF content)

  60. Start
    49479
    Prefix
    В сравнительноиммунологических исследования данный метод чаще всего применятся для изучения процессов апоптоза у представителей костных рыб: обыкновенного карпа C.carpio [60, 61], королевской дорады Sparus aurata [62] и глазчатой рыбы-собаки Takifugu rubripes
    Exact
    [59]
    Suffix
    . Впервые для низших позвоночных животных этот метод был применен Saha и соавторами для оценки способности различных стероидных гормонов запускать апоптоз в лейкоцитах карпа [60]. На рисунке 7 приведены гистограммы, полученные с использованием данного метода (А), а в качестве референсного метода оценки уровня апоптоза в лимфоцитах приведены данные, полученные при комбинированной окраске клето
    (check this in PDF content)

  61. Start
    49659
    Prefix
    данный метод чаще всего применятся для изучения процессов апоптоза у представителей костных рыб: обыкновенного карпа C.carpio [60, 61], королевской дорады Sparus aurata [62] и глазчатой рыбы-собаки Takifugu rubripes [59]. Впервые для низших позвоночных животных этот метод был применен Saha и соавторами для оценки способности различных стероидных гормонов запускать апоптоз в лейкоцитах карпа
    Exact
    [60]
    Suffix
    . На рисунке 7 приведены гистограммы, полученные с использованием данного метода (А), а в качестве референсного метода оценки уровня апоптоза в лимфоцитах приведены данные, полученные при комбинированной окраске клеток AnnV-FITC и PI (гистограмма В).
    (check this in PDF content)

  62. Start
    50151
    Prefix
    По результатам проведенных исследований была обнаружена высокая корреляция между результатами, полученными с использованием комРисунок 7. Изучение проапоптогенной активности стероидных гормонов в отношении лейкоцитов карпа C. carpio
    Exact
    [60]
    Suffix
    Примечание. Гистограмма А: по оси абсцисс – интенсивность флюоресценции PI, по оси ординат – интенсивность флюоресценции FDA. Живые клетки – FDA+PI–, клетки на ранних стадиях апоптоза – негативны по обоим флюоресцентным красителям.
    (check this in PDF content)

  63. Start
    52766
    Prefix
    Маточный раствор готовят из раствора SYBR-14 в ДМСО, после чего аликвотируют и хранят при –20°С, при этом раствор остается стабильным не менее года. Этот метод успешно зарекомендовал себя не только при работе со сперматозоидами млекопитающих
    Exact
    [30, 31, 46]
    Suffix
    , но и с аналогами этих клеток у широкого круга морских беспозвоночных – моллюсков Crassostrea virginica и Dreissena polymorpha, морских ежей Lytechinus variegatus и т.д. [25, 52], примеры приведены на рисунке 8.
    (check this in PDF content)

  64. Start
    52951
    Prefix
    Этот метод успешно зарекомендовал себя не только при работе со сперматозоидами млекопитающих [30, 31, 46], но и с аналогами этих клеток у широкого круга морских беспозвоночных – моллюсков Crassostrea virginica и Dreissena polymorpha, морских ежей Lytechinus variegatus и т.д.
    Exact
    [25, 52]
    Suffix
    , примеры приведены на рисунке 8. Исследование процессов фрагментации ДНК в апоптотической клетке при помощи проточной цитофлюориметрии Фрагментация ДНК является одним из характерных признаков апоптоза, который наиболее часто используется в проточной цитофлюориметрии для выявления популяции клеток, вступивших в апоптоз.
    (check this in PDF content)

  65. Start
    53842
    Prefix
    В дальнейшем процесс фрагментации продолжается, и образуются фрагменты, состоящие в среднем из 30-50 тыс. пар оснований. Все это является следствием активации каскада каспаз (каспазы-3, -6 и -7), который приводит к появлению низкомолекулярный фрагментов ДНК
    Exact
    [24]
    Suffix
    . Первый механизм связан с нарушением способности ДНК к репарации за счет инактивации каспазой-3 фермента поли (АДФ-рибозо) полимеразы – PARP-топоизомеразы, отвечающей за репарацию ДНК. Второй механизм связан с активацией ДНКаз.
    (check this in PDF content)

  66. Start
    54373
    Prefix
    Каспазы (в первую очередь, каспаза-3) способны вызывать диссоциацию комплекса CAD-ICAD, в состав которого входят эндонуклеаза СAD (сaspase-activated Рисунок 8. Применение комбинированной окраски SYBR-14 и PI для определения жизнеспособности сперматозоидов устрицы C. virginica (гистограмма А
    Exact
    [52]
    Suffix
    ; гистограмма В [25]) Примечание. По оси абсцисс – интенсивность флюоресценции SYBR-14, по оси ординат – интенсивность флюоресценции PI. Область 1 – живые клетки; область 2 – клетки с поврежденной плазматической мембраной; область 3 – погибшие клетки. интенсивность флюоресценции SYBR-14 АB 1 1 2 2 33 100 101 103 102 104 100100101101103103102102104104105 105 106 106 100 101 103 102 104 deoxyribon
    (check this in PDF content)

  67. Start
    54393
    Prefix
    Каспазы (в первую очередь, каспаза-3) способны вызывать диссоциацию комплекса CAD-ICAD, в состав которого входят эндонуклеаза СAD (сaspase-activated Рисунок 8. Применение комбинированной окраски SYBR-14 и PI для определения жизнеспособности сперматозоидов устрицы C. virginica (гистограмма А [52]; гистограмма В
    Exact
    [25]
    Suffix
    ) Примечание. По оси абсцисс – интенсивность флюоресценции SYBR-14, по оси ординат – интенсивность флюоресценции PI. Область 1 – живые клетки; область 2 – клетки с поврежденной плазматической мембраной; область 3 – погибшие клетки. интенсивность флюоресценции SYBR-14 АB 1 1 2 2 33 100 101 103 102 104 100100101101103103102102104104105 105 106 106 100 101 103 102 104 deoxyribonuclease – каспазо-ак
    (check this in PDF content)

  68. Start
    55811
    Prefix
    После чего начинается «межнуклеосомная деградация» ДНК с формированием участков, содержащих в среднем 180 пар оснований или кратных им по протяженности, что равняется длине нити ДНК в одной или нескольких нуклеосомах, соответственно
    Exact
    [22, 37]
    Suffix
    . Одним из подходов для исследования апоптоза в клетках при помощи проточной цитофлюориметрии является выявление подобных разрывов в ДНК. Наиболее распространенная методика, применяемая для этих целей, в специализированной литературе получила название TUNEL (от англ. tDT-mediated duTP nick-end labeling).
    (check this in PDF content)

  69. Start
    57307
    Prefix
    Однако потеря низкомолекулярных фрагментов ДНК при окраске флюорохромами оказывается достаточной для того, чтобы отличить нормальные клетки от апоптотических. Итак, все подходы, направленные на выявление разрывов в ДНК, базируются на двух универсальных принципах
    Exact
    [42]
    Suffix
    . Во-первых, при фрагментации ДНК образуются разрывы между отдельными нуклеотидами, что сопровождается высвобождением их 3’-ОН групп, которые, в свою очередь, могут быть выявлены при помощи присоединения к ним нуклеотидов.
    (check this in PDF content)

  70. Start
    58138
    Prefix
    одной из цепей ДНК используют фермент ДНК-полимеразу (технология ISN, от англ. in suty nick), а для присоединения модифицированных нуклеотидов при разрыве обеих цепей ДНК - терминальную дезоксинуклеотидил трансферазу (TdT), применяемую при постановке TUNEL. Следует отметить, что Рисунок 9. Выявление двуцепочечных разрывов в днК апоптотизирующих клетках при помощи проточной цитофлюориметрии
    Exact
    [15, 42]
    Suffix
    Примечание. По оси абсцисс – интенсивность флюоресценции PI; по оси ординат – интенсивность флюоресценции различных «зондов» (комментарии в тексте). Цифрами указано соотношение средних интенсивностей флюоресценции популяций апоптотических и живых клеток.
    (check this in PDF content)

  71. Start
    59336
    Prefix
    Однако наиболее широкое применение нашли непрямые методы оценки встраивания нуклеотидов, основанные на их выявлении при помощи меченых флюорохромами моноклональных антител, показавшие более высокую чувствительность и специфичность. Среди нуклеотидов, применяемых в рамках различных модификаций данной методики, наиболее широкое распространение получил бромдезоксиуридин – BrdU
    Exact
    [42]
    Suffix
    . Это связано с его низкой стоимостью, простотой в использовании, высокой специфичностью связывания, относительной дешевизной антител, используемых для его детекции, а также высокой чувствительностью, как это показано на гистограмме А рисунка 9.
    (check this in PDF content)

  72. Start
    61017
    Prefix
    По завершении фиксации клетки необходимо пермебиализировать для того, чтобы обеспечить доступ ферментов и, в дальнейшем, моноклональных антител к ДНК. Для этого обычно применяют спирты – охлажденный до 0 °С 70% этанол, в этом случае проба может храниться длительное время при -20 °С до постановки реакции
    Exact
    [32]
    Suffix
    . Однако можно использовать и любые другие пермебиализирующие агенты – тритон Х-100, Tween 20, сапонин и т.д. По завершении пермебиализации суспензию клеток отмывают избытком изотонического раствора и ресуспендируют в «реакционном буфере».
    (check this in PDF content)

  73. Start
    61887
    Prefix
    Кроме того, также необходим 10 мМ раствор хлорида кобальта и фермент TdT (обычно 25 МЕ/1 мкл). Более детальный протокол, как и основные рекомендации по подготовке образцов и приготовлению реакционных смесей можно найти в
    Exact
    [15]
    Suffix
    . По завершении инкубации (протекавшей при 37 °С) для выявления встроенного в ДНК BrdU вносят конъюгированные Рисунок 10. оценка уровня апоптоза в циркулирующих гемоцитах асцидии C. intestinalis контрольной (гистограмма А) и экспериментальной (гистограмма В, инъекция бактерий E. coli) группах через 6 часов после начала эксперимента [43] Примечание.
    (check this in PDF content)

  74. Start
    62225
    Prefix
    По завершении инкубации (протекавшей при 37 °С) для выявления встроенного в ДНК BrdU вносят конъюгированные Рисунок 10. оценка уровня апоптоза в циркулирующих гемоцитах асцидии C. intestinalis контрольной (гистограмма А) и экспериментальной (гистограмма В, инъекция бактерий E. coli) группах через 6 часов после начала эксперимента
    Exact
    [43]
    Suffix
    Примечание. По оси абсцисс – интенсивность флюоресценции анти-BrdU антител; по оси ординат – число событий. Область М1 – живые клетки, область М2 – апоптотические клетки. АB интенсивность флюоресценции анти-BrdU антител 100100101 M1M1M2M2 101010131032102104104 0 10 30 20 40 50 с флюорохромами моноклональные антитела, специфически связывающие BrdU.
    (check this in PDF content)

  75. Start
    63405
    Prefix
    В сравнительно-иммунологических исследованиях чаще всего данная методика используется в модификации, предназначенной для оценки результатов при помощи микроскопии. Применение проточной цитофлюориметрии для оценки уровня апоптоза при помощи TUNEL встречается в работах по насекомым
    Exact
    [68]
    Suffix
    и асцидиям [43]. В последней работе методика постановки реакции описана более подробно. В ходе данной серии экспериментов in vivo асцидиям C. intestinalis вводили суспензию бактерий E. coli, контролем служило введение равного объема модифицированного физиологического раствора.
    (check this in PDF content)

  76. Start
    63421
    Prefix
    В сравнительно-иммунологических исследованиях чаще всего данная методика используется в модификации, предназначенной для оценки результатов при помощи микроскопии. Применение проточной цитофлюориметрии для оценки уровня апоптоза при помощи TUNEL встречается в работах по насекомым [68] и асцидиям
    Exact
    [43]
    Suffix
    . В последней работе методика постановки реакции описана более подробно. В ходе данной серии экспериментов in vivo асцидиям C. intestinalis вводили суспензию бактерий E. coli, контролем служило введение равного объема модифицированного физиологического раствора.
    (check this in PDF content)

  77. Start
    65770
    Prefix
    Подобная подготовка образца не приводит к потере крупных фрагментов ДНК, но потеря низкомолекулярных фрагментов при последующей окраске ДНК-флюорохромами оказывается достаточной для того, чтобы отличить нормальные клетки от апоптотических или «гипохромных» клеток, Рисунок 11. Индукция апоптоза в лимфоцитах золотой рыбки C. auratus
    Exact
    [70]
    Suffix
    Примечание. По оси абсцисс – интенсивность флюоресценции PI; по оси ординат – число событий. Область 1 – апоптотические клетки; область 2 – гемоциты в фазах G0 и G1 клеточного цикла; область 3 – S-фаза клеточного цикла; область 4 – G2 и М фазы клеточного цикла.
    (check this in PDF content)

  78. Start
    68409
    Prefix
    В качестве типичного примера окраски клеток ДНК-связывающими красителями можно привести гистограммы, представленные на рисунке 11, на которых представлены результаты окрашивания лимфоцитов золотой рыбки Carassius auratus йодистым пропидием
    Exact
    [70]
    Suffix
    . Кроме того, в рамках изучения апоптоза ДНК-связывающие красители могут применяться для совместно окрашивания клеток вместе с различными другими красителями, ориентированными на выявления нарушения асимметрии клеточной мембраны, изменения мембранного потенциала митохондрий, определения уровня активности каспаз и т.д.
    (check this in PDF content)

  79. Start
    70904
    Prefix
    В рамках сравнительно-иммунологических исследований изучение апоптоза при помощи окраски клеток ДНК-красителями проводится на широком круге модельных объектов, что еще раз указывает на универсальность этого подхода. Встречаются упоминания об использовании DAPI для этих целей, в том числе при постановке экспериментов на гемоцитах моллюсков – устрицы Crassostrea virginica
    Exact
    [28]
    Suffix
    и мидии M. galloprovincialis [6, 47]. Однако чаще всего применяют PI, что обусловлено простотой постановки реакции, низкой себестоимостью и доступностью данного красителя. Так, этот краситель успешно применялся для работы на представителях членистоногих – различные виды ракообразных [41], насекомых [49, 51], а также моллюсков – двустворчатых моллюсков Cerastoderma edule [39] и M. arenaria [16
    (check this in PDF content)

  80. Start
    70938
    Prefix
    -иммунологических исследований изучение апоптоза при помощи окраски клеток ДНК-красителями проводится на широком круге модельных объектов, что еще раз указывает на универсальность этого подхода. Встречаются упоминания об использовании DAPI для этих целей, в том числе при постановке экспериментов на гемоцитах моллюсков – устрицы Crassostrea virginica [28] и мидии M. galloprovincialis
    Exact
    [6, 47]
    Suffix
    . Однако чаще всего применяют PI, что обусловлено простотой постановки реакции, низкой себестоимостью и доступностью данного красителя. Так, этот краситель успешно применялся для работы на представителях членистоногих – различные виды ракообразных [41], насекомых [49, 51], а также моллюсков – двустворчатых моллюсков Cerastoderma edule [39] и M. arenaria [16], как и низших позвоночных на приме
    (check this in PDF content)

  81. Start
    71252
    Prefix
    Однако чаще всего применяют PI, что обусловлено простотой постановки реакции, низкой себестоимостью и доступностью данного красителя. Так, этот краситель успешно применялся для работы на представителях членистоногих – различные виды ракообразных
    Exact
    [41]
    Suffix
    , насекомых [49, 51], а также моллюсков – двустворчатых моллюсков Cerastoderma edule [39] и M. arenaria [16], как и низших позвоночных на примере костных рыб [9, 70], амфибий [20] и т.д. Наиболее подробно данная методика была описана при постановке экспериментов на лимфоцитах золотой рыбки C. auratus [69, 71].
    (check this in PDF content)

  82. Start
    71268
    Prefix
    Однако чаще всего применяют PI, что обусловлено простотой постановки реакции, низкой себестоимостью и доступностью данного красителя. Так, этот краситель успешно применялся для работы на представителях членистоногих – различные виды ракообразных [41], насекомых
    Exact
    [49, 51]
    Suffix
    , а также моллюсков – двустворчатых моллюсков Cerastoderma edule [39] и M. arenaria [16], как и низших позвоночных на примере костных рыб [9, 70], амфибий [20] и т.д. Наиболее подробно данная методика была описана при постановке экспериментов на лимфоцитах золотой рыбки C. auratus [69, 71].
    (check this in PDF content)

  83. Start
    71341
    Prefix
    Так, этот краситель успешно применялся для работы на представителях членистоногих – различные виды ракообразных [41], насекомых [49, 51], а также моллюсков – двустворчатых моллюсков Cerastoderma edule
    Exact
    [39]
    Suffix
    и M. arenaria [16], как и низших позвоночных на примере костных рыб [9, 70], амфибий [20] и т.д. Наиболее подробно данная методика была описана при постановке экспериментов на лимфоцитах золотой рыбки C. auratus [69, 71].
    (check this in PDF content)

  84. Start
    71360
    Prefix
    Так, этот краситель успешно применялся для работы на представителях членистоногих – различные виды ракообразных [41], насекомых [49, 51], а также моллюсков – двустворчатых моллюсков Cerastoderma edule [39] и M. arenaria
    Exact
    [16]
    Suffix
    , как и низших позвоночных на примере костных рыб [9, 70], амфибий [20] и т.д. Наиболее подробно данная методика была описана при постановке экспериментов на лимфоцитах золотой рыбки C. auratus [69, 71].
    (check this in PDF content)

  85. Start
    71414
    Prefix
    Так, этот краситель успешно применялся для работы на представителях членистоногих – различные виды ракообразных [41], насекомых [49, 51], а также моллюсков – двустворчатых моллюсков Cerastoderma edule [39] и M. arenaria [16], как и низших позвоночных на примере костных рыб
    Exact
    [9, 70]
    Suffix
    , амфибий [20] и т.д. Наиболее подробно данная методика была описана при постановке экспериментов на лимфоцитах золотой рыбки C. auratus [69, 71]. Для постановки реакции использовали лимфоциты, выделенные при помощи центрифугирования в градиенте плотности фиколла из лейкоцитов головной почки и селезенки рыб.
    (check this in PDF content)

  86. Start
    71431
    Prefix
    Так, этот краситель успешно применялся для работы на представителях членистоногих – различные виды ракообразных [41], насекомых [49, 51], а также моллюсков – двустворчатых моллюсков Cerastoderma edule [39] и M. arenaria [16], как и низших позвоночных на примере костных рыб [9, 70], амфибий
    Exact
    [20]
    Suffix
    и т.д. Наиболее подробно данная методика была описана при постановке экспериментов на лимфоцитах золотой рыбки C. auratus [69, 71]. Для постановки реакции использовали лимфоциты, выделенные при помощи центрифугирования в градиенте плотности фиколла из лейкоцитов головной почки и селезенки рыб.
    (check this in PDF content)

  87. Start
    71558
    Prefix
    применялся для работы на представителях членистоногих – различные виды ракообразных [41], насекомых [49, 51], а также моллюсков – двустворчатых моллюсков Cerastoderma edule [39] и M. arenaria [16], как и низших позвоночных на примере костных рыб [9, 70], амфибий [20] и т.д. Наиболее подробно данная методика была описана при постановке экспериментов на лимфоцитах золотой рыбки C. auratus
    Exact
    [69, 71]
    Suffix
    . Для постановки реакции использовали лимфоциты, выделенные при помощи центрифугирования в градиенте плотности фиколла из лейкоцитов головной почки и селезенки рыб. После проведения пробоподготовки определяли процент клеток, содержащих гиподиплоидный набор ДНК.
    (check this in PDF content)